蛋白纯化是生物化学和分子生物学研究中的关键步骤，而
GE_AKTAExplorer100蛋白纯化仪的使用直接影响实验的效率和结果的质量。本文将介绍蛋白纯化仪的基本操作技巧，并针对常见问题提供解决方案，帮助研究人员提高实验成功率。
一、GE_AKTAExplorer100蛋白纯化仪的基本操作技巧
1.样品准备
-样品澄清：在纯化前，需通过离心或过滤去除细胞碎片和不溶性杂质，避免堵塞层析柱。
-缓冲液匹配：确保样品缓冲液的pH、离子强度和成分与层析柱的平衡缓冲液一致，以减少非特异性结合。
2.层析柱的选择与平衡
-选择合适的层析柱：根据目标蛋白的特性选择亲和层析、离子交换层析或分子筛层析等。
-充分平衡：在进样前，用至少5-10倍柱体积的缓冲液平衡层析柱，确保pH和离子强度稳定。
3.上样与洗脱
-控制流速：上样时流速不宜过快，避免蛋白未充分结合就流失。通常建议流速为0.5-2mL/min（视柱体积而定）。
-梯度洗脱优化：对于离子交换层析，可采用线性或阶梯式盐梯度洗脱，提高分辨率。
4.收集与检测
-分步收集：使用自动馏分收集器，按时间或体积分段收集洗脱液，便于后续分析。
-实时监测：利用UV检测器（280nm）监测蛋白峰，确保目标蛋白的准确收集。
5.层析柱的维护
-及时清洗：每次使用后，用高盐（如1MNaCl）或低pH缓冲液清洗层析柱，去除残留蛋白。
-正确保存：长期不用时，层析柱应保存在20%乙醇或专用保存缓冲液中，防止微生物生长。
二、常见问题及解决方案
1.层析柱堵塞
-可能原因：样品含有颗粒物或沉淀。
-解决方案：
-上样前高速离心（12,000rpm，10min）或0.22μm滤膜过滤。
-若已堵塞，可反向冲洗层析柱，或更换筛板。
2.蛋白回收率低
-可能原因：
-蛋白未结合（缓冲液不匹配）。
-洗脱条件过强，导致蛋白失活。
-解决方案：
-优化结合缓冲液的pH和离子强度。
-采用温和洗脱条件（如降低洗脱盐浓度或延长梯度时间）。
3.洗脱峰拖尾
-可能原因：
-蛋白与层析介质非特异性结合。
-洗脱梯度不够陡峭。
-解决方案：
-在缓冲液中加入去垢剂或竞争性洗脱剂。
-优化洗脱梯度，提高分辨率。
4.基线漂移或噪音大
-可能原因：
-缓冲液未充分脱气，导致气泡进入检测器。
-UV检测器污染或光源不稳定。
-解决方案：
-使用前对缓冲液进行脱气处理。
-定期清洁检测器流通池，检查光源寿命。
5.蛋白聚集或沉淀
-可能原因：
-纯化过程中蛋白浓度过高。
-缓冲液成分不合适（如pH偏离等电点）。
-解决方案：
-降低蛋白浓度，或添加稳定剂（如甘油、DTT）。
-调整缓冲液pH，避免蛋白在等电点附近沉淀。
6.层析柱寿命短
-可能原因：
-未正确清洗和保存层析柱。
-样品中含有蛋白酶或核酸污染。
-解决方案：
-每次使用后清洗，并严格按厂商建议保存。
-在样品中添加蛋白酶抑制剂或核酸酶。
